OBTENÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS DE MADEIRA

A madeira, em geral, é um material que oferece boa resistência mecânica ao corte. Como tal, necessita de equipamento adequado para ser corretamente seccionada em fina espessura.
O micrótomo de deslizamento é o aparelho indicado, pois consegue fixar bem o corpo de prova para que uma navalha móvel deslize paralela as linhas do parênquima radial e assim obtenha-se os cortes.
A navalha usada deve ser de aço de boa têmpera para que não desgaste com facilidade e prejudique assim o trabalho. As navalhas adequadas para seccionamento de madeira devem ser dos tipos “C” ou “D”, de superfície reta.
O micrótomo possui uma regulagem que varia de 1 a 60 micrômetros, Para cortes de xilema, o ideal está entre 14-20 micrômetros.

CORPO DE PROVA

É necessário retirar da amostra de madeira um pequeno pedaço de um local isento de deformidades, na altura de aproximadamente 1,30 m do solo que constituirá o corpo de prova. Este deve medir em torno de 1,0 cm cúbico.
Deverá passar então por um processo preparatório para permitir seu seccionamento no micrótomo. Existem várias maneiras de tornar a madeira mais macia e apropriada para o seccionamento, como tratamento em autoclave, cozimento em água e tratamentos químicos. O mais comum e que oferece resultados seguros é sem dúvida o cozimento em água e glicerina na proporção de 5 para 1. O tempo é variável de acordo com a dureza da espécie: em algumas coníferas bastam 3 horas de fervura e já se pode cortar sem problemas. Com algumas folhosas, porém, o tempo  de fervura pode chegar a vários dias ou até semanas.
Um tratamento químico para amolecimento que também oferece excelentes resultados consiste em mergulhar o corpo de prova em etilenodiamina à concentração de 5 ou 10%. É indicado para madeiras duras ou muito duras, tornando os cortes viáveis num prazo de um a três dias, dependendo do grau de lignificação da madeira. O aquecimento da solução em capela - os vapores são tóxicos - acelera o amolecimento. É preciso tomar cuidado na diluição do etilenodiamina, produto corrosivo e fumegante em contato com o ar, podendo causar sérias queimaduras. O uso de Equipamento de Proteção Individual é recomendável, além de que deve ser manipulado em capela. O produto mesmo depois de diluído oferece riscos.

CORTANDO NO MICRÓTOMO

A fase seguinte é a de produção dos cortes. O corpo de prova deve estar bem fixo nas garras do micrótomo para não movimentar-se durante o momento de atrito com a navalha. Deve-se ajustar o ângulo para que a superfície transversal esteja paralela à face inferior da navalha. O ângulo de penetração da navalha no corpo de prova também deve ser ajustado. Escolhe-se a altura dos cortes (14 ou 16 micrômetros por exemplo) e faz-se com que a navalha passe sobre a superfície do corpo sem hesitação. Os cortes devem ser colhidos com auxílio de um pincel e depositados em placa de Petri com água destilada.

PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS

Lava-se então os cortes com água destilada duas vezes para retirar os vestígios da água sanitária.
Os cortes que serão montados em lâminas permanentes passam por uma série alcóolica hidratada, da menor concentração até álcool etílico absoluto (20%, 40%, 60%, 80% e 100%) com a intenção de desidratá-los para que possam ser fixados em Bálsamo do Canadá ou outro meio (permount, araldite, etc.).
Entre as lavagens com álcool há a imersão dos cortes em corante. A coloração do xilema obedece ao objetivo que se destina e deve ser feita de modo a não inverter o processo de desidratação dos cortes. Por exemplo: se o corante foi formulado com álcool 70%, deve-se corar o tecido após este ter sido lavado com álcool 60% e antes da lavagem com álcool 80%, caso contrário estaríamos reidratando os cortes. Como a parede das células do xilema possui grande quantidade de lignina, um corante que tenha afinidade por esta substância certamente irá produzir bons resultados. Eventualmente utiliza-se também o corante astrablau que tem afinidade por celulose, para evidenciar células parenquimáticas e abertura de pontoações. Outras vezes é usado o artifício da dupla coloração, com fuccina + verde malachita ou safranina + verde malachita para evidenciar o grau de lignificação da parede das células. Outros corantes também produzem excelentes resultados como a hematoxilina ou o verde-iodo. Mas, como já foi dito, o corante deve ser adequado à expectativa do resultado.
Após a coloração e as sucessivas lavagens em álcool mergulha-se os cortes em acetato de butila e apara-se as bordas com lâmina de barbear ou bisturi.
Espalha-se bálsamo do Canadá sobre a lâmina de vidro com um palito e  com auxílio de um pincel macio transfere-se os cortes, um de cada plano, do acetato para a lâmina. Passa-se bálsamo também sobre uma das faces da lamínula e sobre cada um dos cortes. A lamínula então é depositada sobre os cortes cuidadosamente de modo a evitar bolhas de ar.
A lâmina uma vez montada deverá ser submetida à pressão de pequenos pesos de ferro para uniformizar o bálsamo e expulsar alguma bolhinha que por ventura tenha ficado retida nos cortes. Secará durante aproximadamente uma semana, quando será feita a raspagem do excesso de bálsamo e limpeza da lâmina com acetato. Todo o material deve ser identificado com etiquetas para evitar que se confunda e se perca o trabalho.

OBTENÇÃO DE LÂMINAS DE TECIDO MACERADO

 Através das lâminas de tecido macerado é possível visualizar cada célula do xilema separadamente. A solução sugerida a seguir consegue efetivamente dissolver a lamela média, que une as células, desagregando-as.

SOLUÇÃO MACERANTE

50% de ácido acético glacial
38% de Peróxido de Hidrogênio 130 V.
12% de água destilada

PROCEDIMENTO

Retirar pequeninos cavacos de madeira com auxílio de navalha e colocá-los em frasco com tampa rosqueável. Cobrí-los com a solução e levar para a estufa a 50-60o C por 24h ou mais.
Destampar, cobrir a abertura do frasco com meia de nylon e colocar sob água corrente, na torneira, até desaparecer o cheiro de ácido acético.
Esvaziar toda a água do vidro e coletar o material histológico aderido à meia com uma espátula e transportá-lo para um vidro de relógio onde deverá receber o corante.

Obs.: A meia deve ser bem lavada para evitar contaminação nos próximos materiais.

Colorir com safranina ou fuccina durante 5-15 minutos.
Pingar uma gota de glicerina sobre a lâmina e depositar um pouco do material já corado. Fazer esfregaço com a lamínula.
Em geral estas lâminas duram de 2- 5 dias. Para maior vida útil das lâminas efetuar  lutagem com esmalte incolor.

METODOLOGIA PARA PREPARAÇÃO DE ALGUNS CORANTES PARA MADEIRA
SAFRANINA (100 ml)
50 ml de água destilada
50 ml de álcool etílico absoluto
1 g de Safranina
 Diluir a safranina no álcool hidratado lentamente, até que a diluição seja uniforme e não forme precipitado.

VERDE MALACHITA ( 100 ml)
95 ml de álcool etílico absoluto
5 ml de água destilada
0,5 g de Verde Malachita
Preparar o álcool hidratado e reservar uma parte para em um becker iniciar a diluição do corante em separado. Após o preparo, cobrir o recipiente com papel alumínio para evitar contato com luz durante 24 horas.
Utilizar vidro escuro para guardar. Este corante apresenta o sério inconveniente de ser pouco resistente a exposição de luz, desaparecendo a coloração em pouco tempo.

FUCCINA ÁCIDA ( 100 ml)
50 ml de água destilada
50 ml de álcool etílico absoluto
1 g de fuccina ácida
  Efetuar a diluição da mesma maneira da safranina.

HEMATOXILINA DE DELAFIELD (150 ml)
1 g de hematoxilina dissolvido em 5 ml de álcool 95%.
100 ml de solução saturada de alúmen amoniacal
25 ml de glicerina
25 ml de álcool 95%
 Misturar  a hematoxilina dissolvida no álcool com os 100 ml de alúmen amoniacal. Deixar exposto ao ar e luz durante uma semana. Filtrar e adicionar 25 ml de glicerina e 25 ml de álcool a 95%. Após algumas horas filtrar.

CRYSOIDINA-ACROIDINA VERMELHA
0,5 g de Crysoidina
0,5 de Acroidina vermelha
190 ml de água destilada
1 ml de ácido acético
Alúmen de amoníaco (5 g de sulfato de alumínio amoniacal em 100 ml de água destilada)
 Misturar a crysoidina e a acroidina em 190 ml de água destilada. Adicionar solução aquosa de 0,5% de alúmen de amoníaco, 1 ml de ácido acético e mexer durante 5 minutos.
 Este corante evidencia cristais em tom amarelo-alaranjado.